最新国产V亚洲V欧美V专区,国产亚洲欧美一区二区,天堂香港黄色网站,亚洲影院天堂中文AV色,精品操操操操操操,成人三级片无码

您好,歡迎進(jìn)入上海莼試生物技術(shù)有限公司網(wǎng)站!
全國(guó)服務(wù)熱線:13585831301
上海莼試生物技術(shù)有限公司
您現(xiàn)在的位置:首頁(yè) > 技術(shù)文章 > 多瘤病毒(BK) 核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)ǎ┓磻?yīng)流程常規(guī)程序

多瘤病毒(BK) 核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)ǎ┓磻?yīng)流程常規(guī)程序

瀏覽次數(shù):1295發(fā)布日期:2020-10-28

多瘤病毒(BK) 核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)ǎ?/strong>反應(yīng)流程常規(guī)程序

將PCR反應(yīng)所需的成分配置完后,在PCR儀上于94-96℃預(yù)加熱幾十秒至幾分鐘,使模板DNA充分變性,然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)中,先于94℃保持30秒鐘使模板變性,然后將溫度降到復(fù)性溫度(一般50-60℃之間),一般保持30秒鐘,使引物與模板充分退火;在72℃保持1分鐘(擴(kuò)增1kb片段),使引物在模板上延伸,合成DNA,完成一個(gè)循環(huán)。重復(fù)這樣的循環(huán)25~35次,使擴(kuò)增的DNA段大量累積。后,在72℃保持3-7min,使產(chǎn)物延伸完整,4℃保存。

2.復(fù)性(退火)和延伸溫度

復(fù)性的溫度是PCR擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素,通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為72℃。如果復(fù)性的溫度很高,可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度,變成二步法PCR。

3.反應(yīng)時(shí)間

變性步驟一般使用30秒鐘,如果模板的G+C含量較高,或直接用細(xì)胞做模板,變性時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。復(fù)性時(shí)間有30秒種一般是足夠的。延伸時(shí)間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定,一般采用1kb用1分鐘來(lái)保證充足的時(shí)間。

4.循環(huán)次數(shù)

循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān),在模板拷貝數(shù)為104~105數(shù)量級(jí)時(shí),循環(huán)數(shù)通常為25~35次。

平臺(tái)效應(yīng)(plateaueffect):PCR擴(kuò)增過(guò)程后期會(huì)出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長(zhǎng)的現(xiàn)象。原因:底物和引物的濃度已經(jīng)降低,dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低,產(chǎn)生的焦磷酸會(huì)出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用,非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競(jìng)爭(zhēng)作用,擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性,高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不*。

5.PCR反應(yīng)液的配制

PCR反應(yīng)體系的配置方式有時(shí)也會(huì)影響反應(yīng)的正常進(jìn)行。常規(guī)方法與其它酶學(xué)反應(yīng)一樣,在后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒(méi)有帶加熱的蓋子,要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油,防止水分蒸發(fā)。

對(duì)于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時(shí),有時(shí)會(huì)擴(kuò)增不出產(chǎn)物。在遇到這個(gè)問(wèn)題時(shí),如果將反應(yīng)成分分開(kāi)配制,A管含模板、引物和dNTP,以及調(diào)整體積的H2O,B管含緩沖液、DNA聚合酶和水,然后再將兩管溶液混合起來(lái),可較好地克服這個(gè)問(wèn)題。

按照常規(guī)的方法配制反應(yīng)體系,有時(shí)會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的問(wèn)題。熱啟動(dòng)(hotstart)PCR操作方式可較好解決這一問(wèn)題。將dNTP、緩沖液,Mg2+和primer先配制好,然后加入一粒蠟珠(如AmpliWaxPCRQam100),加熱熔化,再冷卻,使蠟將溶液封住,后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)入高溫階段后,蠟層熔化,所有反應(yīng)成分才會(huì)混合在一起。

Contact Us
  • 聯(lián)系QQ:3004972506
  • 聯(lián)系郵箱:sdfskdfhs3004972506@qq.com
  • 傳真:86-021-60443211
  • 聯(lián)系地址:上海嘉定區(qū)嘉羅公路1661

掃一掃  微信咨詢

©2024 上海莼試生物技術(shù)有限公司 版權(quán)所有  備案號(hào):滬ICP備17029297號(hào)-3  技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng)    GoogleSitemap    總訪問(wèn)量:101511 管理登陸

靖边县| 始兴县| 深水埗区| 德化县| 灵武市| 永丰县| 苍山县| 穆棱市| 崇阳县| 徐汇区| 衡东县| 伊春市| 广德县| 武宁县| 长治市| 瓮安县| 虹口区| 天台县| 且末县| 石林| 海城市| 镇原县| 洛隆县| 浮山县| 全椒县| 珠海市| 阿拉善盟| 疏附县| 永修县| 平原县| 普洱| 新野县| 浏阳市| 冕宁县| 汝城县| 天峻县| 万荣县| 雅安市| 青州市| 小金县| 灵宝市|