淋巴成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法:
1、細(xì)胞傳代:細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代
①棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次;
②加入2ml0.25%胰酶(T25瓶),使胰酶覆蓋整個(gè)瓶或皿,蓋好放入培養(yǎng)箱消化;
③1-2min后,顯微鏡下觀察細(xì)胞,若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化;若細(xì)胞還是貼壁,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止;
④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清;
⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基;
⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集,細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。
2、細(xì)胞復(fù)蘇:
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,時(shí)間1min左右,加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。
3、細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種
①棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次,加入1mL 0.25%胰蛋白酶(T25瓶)
②1-2min后,顯微鏡下觀察細(xì)胞,大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化;
③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,加1ml凍存液重懸細(xì)胞;
④將凍存管放入程序降溫盒,放入-80℃冰箱,4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。
4、細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力評(píng)估:在進(jìn)行細(xì)胞傳代、復(fù)蘇或凍存前,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力評(píng)估是至關(guān)重要的步驟。①取少量細(xì)胞懸液,與等體積的0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液混合,靜置2-3分鐘。②使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,在顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞(未被臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞)與死細(xì)胞(被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色的細(xì)胞)。③計(jì)算細(xì)胞總數(shù)及活力百分比(活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。確保細(xì)胞活力高于90%方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
5、培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化:淋巴成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)還需注意培養(yǎng)環(huán)境的細(xì)節(jié)優(yōu)化。①維持培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度恒定在37℃,濕度飽和,并通入5% CO?以保持適宜的pH值。②定期更換培養(yǎng)基,一般為每2-3天一次,以去除代謝產(chǎn)物,補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。③使用經(jīng)過滅菌處理的器材和試劑,減少污染風(fēng)險(xiǎn)。通過這些措施,可以進(jìn)一步提升細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),促進(jìn)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
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