注意事項(xiàng):1.基礎(chǔ)程序;2.?dāng)U增溫度和延伸溫度;3.反應(yīng)時間;4.循環(huán)次數(shù);5.PCR 反應(yīng)液的配制;6.PCR技術(shù)的基本原理;7.PCR的反應(yīng)動力學(xué);8.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;9.PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。
產(chǎn)品名稱 | 殺蠣包拉米蟲探針法熒光定量PCR檢測試劑盒 |
英文名稱 | Bonamia exitiosus |
貨號 | CP933963 |
儲存條件:
14℃或-20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液:3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
探針法:
殺蠣包拉米蟲探針法熒光定量PCR檢測試劑盒aqMan 探針是一種寡核苷酸探針,它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團(tuán)連接在探針的5’ 末端,而淬滅劑則在3’ 末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時,熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時,聚合酶的5’ 外切酶活性將探針進(jìn)行酶切,使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加,釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。相對于染料法,Taqman探針法具有更高的特異性和準(zhǔn)確性。
使用方法:
一、樣品DNA的制備
用自選方法提取細(xì)菌樣品DNA。注意:DNA純化方法是決定檢測靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA,后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測靈敏度。
二、制備O157:H7標(biāo)準(zhǔn)曲線(以10-10E6這6個10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽性對照,只提供沒有傳染性的、可以直接使用的DN段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記6個離心管,分別為6,5,4,3,2和1號。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水(用帶芯槍頭,下同)。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL(注:請不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至10E7拷貝/μL,建議每次稀釋10倍,梯度稀釋至10E7拷貝/μL)。
4. 在6號管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得10E6拷貝/μL的陽性對照。
5. 換槍頭,從6號管中取5 μL溶液到5號管中,充分震蕩1分鐘,得10E5拷貝/μL的陽性對照。
6. 換槍頭,從5號管中取5 μL溶液到4號管中,重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。
7. NC管中不加任何陽性對照。
8. 從1-6號管中分別取5 μL和待測樣品一起進(jìn)行定量PCR(見下步),每個樣品做3次重復(fù)。PCR后得到每個陽性對照稀釋樣品的熒光PCR Ct值,并以之為縱軸,以濃度的對數(shù)值為橫軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖:
應(yīng)用案例:
樣品 DNA 的制備
1.用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費(fèi)贈送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝(一管式病毒 DNAout 的成分)。
稀釋陽性對照(以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DN段作為陽性對照。
2.標(biāo)記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩 1 分鐘,得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。5.換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭,在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中,得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用
8.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。設(shè)置 qPCR 反應(yīng)(20 μL 體系,在樣品制備室進(jìn)行)
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在銷售的產(chǎn)品:
奧芬那君相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品人抗型肝炎病IgG抗體(anti-HAV)ELISA Kit,48T/96T
奧芬那君相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品羊促生長激素釋放激素(GHRH)ELISA Kit,48T/96T
酸奧斯他韋標(biāo)準(zhǔn)品人促生長激素釋放激素(GHRH)ELISA Kit,48T/96T
奧塞米韋相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品小鼠促生長激素釋放激素(GHRH)ELISA Kit,48T/96T
苯唑西林鈉標(biāo)準(zhǔn)品豬促生長激素釋放激素(GHRH)ELISA Kit,48T/96T
奧沙利鉑對照品標(biāo)準(zhǔn)品大鼠促生長激素釋放激素(GRH)ELISA Kit,48T/96T
奧沙利鉑相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品人抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體(AECA)ELISA Kit,48T/96T
奧沙利鉑相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品小鼠抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體(AECA)ELISA Kit,48T/96T
奧沙利鉑相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品大鼠抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體(AECA)ELISA Kit,48T/96T
奧沙利鉑相關(guān)物質(zhì)D標(biāo)準(zhǔn)品兔抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體(AECA)ELISA Kit,48T/96T
奧沙利鉑相關(guān)物質(zhì)F標(biāo)準(zhǔn)品人抗型肝炎病IgM抗體(anti-HAV)ELISA Kit,48T/96T
奧沙利鉑標(biāo)準(zhǔn)品(系統(tǒng)使用性用)犬促黃體生成激素(LH)ELISA Kit,48T/96T
殺蠣包拉米蟲探針法熒光定量PCR檢測試劑盒氧雄龍標(biāo)準(zhǔn)品雞促黃體激素(LH)ELISA Kit,48T/96T
氧雄龍相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品人促黃體激素(LH)ELISA Kit,48T/96T
氧雄龍相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品小鼠促黃體激素(LH)ELISA Kit,48T/96T CXCL9/MIG γ干擾素誘導(dǎo)單核細(xì)胞因子抗體角鯊烯
CXCL7/NAP-2/PPBP 血小板趨化因子7蛋白抗體γ-氨酪酸
CXCL5 上皮中性粒細(xì)胞活化肽78抗體胸腺五肽
CXCL4/PF4 血小板因子4抗體賴脯胰島素
CXCL16 CXC趨化因子16抗體醋酸奧曲肽
CXCL15/Lungkine 趨化因子CXCL15抗體尤瑞克林
CXCL14 CXC趨化因子14抗體門冬酰胺酶(大腸桿菌)
CXCL13/BCA1 B-淋巴細(xì)胞趨化因子抗體門冬酰胺酶(歐文菌)
CXCL13/BCA1 B-淋巴細(xì)胞趨化因子抗體5'-胞苷酸
CXCL11 干擾素誘導(dǎo)T細(xì)胞趨化因子抗體4'-羥基苯酸
CXCL10 CXCL10趨化因子10/干擾素誘導(dǎo)蛋白10抗體5'-羥基吲哚酸
CX3CR1 趨化因子受體1抗體馬尿酸
CX3CL1 CX3CL1抗體苯酰谷氨酰胺
CWH43 細(xì)胞壁合成蛋白43抗體氧化型谷胱甘肽
CWF19L1 CWF19L1蛋白抗體門冬酰胺
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