培養(yǎng)步驟:
一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備:
1)準備MEM培養(yǎng)基(MEM:GIBCO,貨號11095-080),85%;北美胎牛血清(United States,GIBCO,貨號16000-044),15%。
2)培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37攝氏度,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3)凍存液:90%*培養(yǎng)基,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。
二.細胞處理:
1)復(fù)蘇細胞:將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中,加入約8ml培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜)。第二天換液并檢查細胞密度。
2)細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞,傳代可參考以下方法:
1.棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)細胞凍存:待細胞生長狀態(tài)良好時,可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時,棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶,細胞變圓脫落后,加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中,再添加10%DMSO后進行凍存。
人血管內(nèi)皮細胞提取物是從人原代血管內(nèi)皮細胞提取的,人原代血管內(nèi)皮細胞從正常人血管內(nèi)皮組織制備。正常人血管內(nèi)皮組織采集自各地方醫(yī)院,采集工作根據(jù)IRB 和 HIPAA批準的方案進行。所有的產(chǎn)品在發(fā)貨之前均經(jīng)過嚴格的QA/QC流程以確保其質(zhì)量。這些產(chǎn)品可以直接用于基因克隆,表達圖譜分析以及各種分子生物學(xué)實驗的研究。
總RNA制備:利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA,然后用Qiagen RNA Clean Kit進行純化。公司提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度、總含量、電泳照片、OD值測定結(jié)果等。
cDNA制備:純化后的總RNA來合成cDNA鏈,以50ul總反應(yīng)體系進行逆轉(zhuǎn)錄,體系中包括MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機引物以及10mg總RNA。68℃反應(yīng)10min 后終止RT反應(yīng)。利用1x RT Buffer 運輸cDNA,1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應(yīng)。所有cDNA產(chǎn)品在訂單發(fā)貨之前都經(jīng)過了嚴格的QA/QC分析,保證了產(chǎn)品的質(zhì)量。
蛋白制備:利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備人血管內(nèi)皮組織裂解液,離心去除組織碎片,通過Bio-Rad蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度,組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF,-80度保存。
潛在的應(yīng)用: <1>已知基因的PCR克??;<2>mRNA選擇性剪接;<3>基因克隆與目標測序;<4> Western and Northern Blot;<5>蛋白檢測與蛋白質(zhì)組學(xué);<6>芯片研究與表達圖譜。
產(chǎn)品名稱 | 人血管內(nèi)皮細胞提取物 |
英文名稱 | Human Vascular: Normal Vascular Endothelial Cell Derivatives |
貨號 | CS-X3566 |
細胞分類:
一種:
是凍存產(chǎn)品,由氮直液接拿出,干冰運輸給客戶。一般不推薦這種,也較少使用這種方式,因為復(fù)蘇手法對于細胞狀態(tài)影響較大,一旦細胞狀態(tài)不好,很難說是細胞自身不行,還是復(fù)蘇沒操作好;另外溫度對細胞、基因功能狀態(tài)影響很大,也不是細胞儲存的方式,快遞時間也很難控制,多種因素影響產(chǎn)品的質(zhì)量;干冰運輸需要額外添加400元的運費(順豐)。
第二種:
是我們復(fù)蘇好細胞,QC通過后,T-25灌滿培養(yǎng)基常溫運輸給客戶,排除復(fù)蘇造成影響,常溫運輸也對細胞影響也不大,只需加25元運費(順豐)。
質(zhì)量保證:我們的細胞株來源于ATCC、ECACC、DSMZ、JCRB等,購買到貨后,由我們實驗室擴增、凍存,凍存的產(chǎn)品全部經(jīng)過QC檢測,進口來源,保證5代以內(nèi),活力>95%,無細菌、真菌、支原體污染。
細胞培養(yǎng)的優(yōu)點:
1.研究的對象是活細胞
在實驗過程中,根據(jù)要求可始終保持細胞活力,并可長時間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一部分活細胞的情況,包括活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等。
2.研究條件可以人為控制
pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學(xué)的條件,可以根據(jù)實際需要進行人為的控制,同時,可以施加化學(xué)、物理、生物等因素作為條件而進行實驗觀察,這些因素同樣可以處于嚴格控制之下。
3.研究的樣本可以達到比較均一性
通過細胞培養(yǎng)一定代數(shù)后,所得到的細胞系則可以達到均一性而屬于同一類型的細胞,需要時,可采用克隆化等方法使細胞達到純化。
4.研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄
采用各種研究技術(shù):如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標記等各種儀器設(shè)備。
以下是公司正在銷售的相關(guān)產(chǎn)品:
0.281ng/ml人1,3-二甘油(1,3-DPG)ELISA試盒M-TriDAP
46.875pg/ml人1,25二羥基維生素D3(1,25-(OH)2D3/DVD/DHVD 3)ELISA試盒M-TriLYS
0.938ng/ml雞蛋卵黃高蛋白肽(PPP)ELISA試盒Tri-DAP
0.094ng/ml雞卵黃免疫球蛋白(IgY)ELISA試盒PGN-ECndi ultrapure, insoluble
46.875pg/ml倉鼠狀腺結(jié)合球蛋白(TBG)ELISA試盒PGN-ECndss ultrapure, soluble
0.75nmol/ml倉鼠核因子κB受體活化因子配基(RANKL)ELISA試盒PGN-SAndi ultrapure, insoluble
0.188ng/ml倉鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9/膠酶B(MMP-9/Gelatinase B) ELISA試盒Murabutide
9.375pg/ml 倉鼠組織蛋白酶K(cath-K)ELISA試盒C12-iE-DAP
46.875pg/ml豚鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試盒C14-Tri-LAN-Gly
0.094ng/ml豚鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)ELISA試盒 N-Glycolyl-MDP
人血管內(nèi)皮細胞提取物2',5'-寡腺苷合成酶1(OAS1)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)紫香酚苷(標準品)
白介素22受體α2(IL2Rα2)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)紫花前胡苷(標準品)
腫廇蛋白P63(TP63)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)紫蓳靈(標準品)
橋粒芯膠粘蛋白1(DSC1)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)紫云英苷(標準品)
夏科雷登氏結(jié)晶蛋白(CLC)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)棕櫚(標準品)
防御素α3(DEFα3)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)王不留行黃苷(標準品)
卵泡抑素樣蛋白1(FSTL1)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)絡(luò)塞琳(標準品)
小板反應(yīng)蛋白2(THBS2)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)絡(luò)緦(標準品)
晶狀體蛋白αB(CRYαB)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)AT7519.HCl
晶狀體蛋白αB(CRYαB)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)培利替尼;貝利替尼;EKB569
解整合素金屬蛋白酶10(ADAM10)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)雷公藤素(標準品)
小板衍生生長因子受體樣蛋白(PDGFRL)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)番瀉苷C(標準品)
小板衍生生長因子受體樣蛋白(PDGFRL)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)番瀉苷D(標準品)
饑餓素(GHRL)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)二辣椒(標準品)
管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)五味子酯(標準品)
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