培養(yǎng)步驟:
一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備:
1)準(zhǔn)備MEM培養(yǎng)基(MEM:GIBCO,貨號(hào)11095-080),85%;北美胎牛血清(United States,GIBCO,貨號(hào)16000-044),15%。
2)培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37攝氏度,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3)凍存液:90%*培養(yǎng)基,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。
二.細(xì)胞處理:
1)復(fù)蘇細(xì)胞:將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中,加入約8ml培養(yǎng)基,培養(yǎng)過(guò)夜)。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞,傳代可參考以下方法:
1.棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,然后在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺(tái),輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí),棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶,細(xì)胞變圓脫落后,加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中,再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。
大鼠腎小管平滑肌細(xì)胞提取物是從大鼠原代腎小管平滑肌細(xì)胞提取的,大鼠原代腎小管平滑肌細(xì)胞從正常大鼠腎小管組織制備。所有的產(chǎn)品在發(fā)貨之前均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的QA/QC流程以確保其質(zhì)量。這些產(chǎn)品可以直接用于基因克隆,表達(dá)圖譜分析以及各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究。
總RNA制備:利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA,然后用Qiagen RNA Clean Kit進(jìn)行純化。公司提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度、總含量、電泳照片、OD值測(cè)定結(jié)果等。
cDNA制備:純化后的總RNA來(lái)合成cDNA鏈,以50ul總反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,體系中包括MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物以及10mg總RNA。68℃反應(yīng)10min 后終止RT反應(yīng)。利用1x RT Buffer 運(yùn)輸cDNA,1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應(yīng)。所有cDNA產(chǎn)品在訂單發(fā)貨之前都經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的QA/QC分析,保證了產(chǎn)品的質(zhì)量。
蛋白制備:利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備大鼠腎小管平滑肌組織裂解液,離心去除組織碎片,通過(guò)Bio-Rad蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度,組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF,-80度保存。
潛在的應(yīng)用: <1>已知基因的PCR克隆;<2>mRNA選擇性剪接;<3>基因克隆與目標(biāo)測(cè)序;<4> Western and Northern Blot;<5>蛋白檢測(cè)與蛋白質(zhì)組學(xué);<6>芯片研究與表達(dá)圖譜。
產(chǎn)品名稱(chēng) | 大鼠腎小管平滑肌細(xì)胞提取物 |
英文名稱(chēng) | Rat Tubular:Normal TubularDerivatives |
貨號(hào) | CS-X3742 |
細(xì)胞分類(lèi):
一種:
是凍存產(chǎn)品,由氮直液接拿出,干冰運(yùn)輸給客戶(hù)。一般不推薦這種,也較少使用這種方式,因?yàn)閺?fù)蘇手法對(duì)于細(xì)胞狀態(tài)影響較大,一旦細(xì)胞狀態(tài)不好,很難說(shuō)是細(xì)胞自身不行,還是復(fù)蘇沒(méi)操作好;另外溫度對(duì)細(xì)胞、基因功能狀態(tài)影響很大,也不是細(xì)胞儲(chǔ)存的方式,快遞時(shí)間也很難控制,多種因素影響產(chǎn)品的質(zhì)量;干冰運(yùn)輸需要額外添加400元的運(yùn)費(fèi)(順豐)。
第二種:
是我們復(fù)蘇好細(xì)胞,QC通過(guò)后,T-25灌滿(mǎn)培養(yǎng)基常溫運(yùn)輸給客戶(hù),排除復(fù)蘇造成影響,常溫運(yùn)輸也對(duì)細(xì)胞影響也不大,只需加25元運(yùn)費(fèi)(順豐)。
質(zhì)量保證:我們的細(xì)胞株來(lái)源于A(yíng)TCC、ECACC、DSMZ、JCRB等,購(gòu)買(mǎi)到貨后,由我們實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增、凍存,凍存的產(chǎn)品全部經(jīng)過(guò)QC檢測(cè),進(jìn)口來(lái)源,保證5代以?xún)?nèi),活力>95%,無(wú)細(xì)菌、真菌、支原體污染。
細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn):
1.研究的對(duì)象是活細(xì)胞
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,根據(jù)要求可始終保持細(xì)胞活力,并可長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)控、檢測(cè)甚至定量評(píng)估一部分活細(xì)胞的情況,包括活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)等。
2.研究條件可以人為控制
pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學(xué)的條件,可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行人為的控制,同時(shí),可以施加化學(xué)、物理、生物等因素作為條件而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀(guān)察,這些因素同樣可以處于嚴(yán)格控制之下。
3.研究的樣本可以達(dá)到比較均一性
通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)一定代數(shù)后,所得到的細(xì)胞系則可以達(dá)到均一性而屬于同一類(lèi)型的細(xì)胞,需要時(shí),可采用克隆化等方法使細(xì)胞達(dá)到純化。
4.研究?jī)?nèi)容便于觀(guān)察、檢測(cè)和記錄
采用各種研究技術(shù):如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記等各種儀器設(shè)備。
以下是公司正在銷(xiāo)售的相關(guān)產(chǎn)品:
0.375ng/ml10×MOPS 緩沖液Wash Buffer 1 for MagJET Viral Kit (concentrated)
0.469ng/ml20×SSC pH7.0TOPVISION AGAROSE TABLETS
0.188ng/ml20×SSC pH7.0TOPVISION AGAROSE TABLETS
0.188ng/mlSSC緩沖液(20×, pH7.0, RNase free) LAMBDA DNA
0.938ng/ml20×SSC pH5.3LAMBDA DNA (DAM-,DCM-)
0.094ng/ml20×SSC pH5.3PHIX174 RF1 DNA
18.75pg/ml20×SSC pH7.4PBR322 DNA
28.125pg/ml20×SSC pH7.4PUC18 DNA
18.75pg/ml20×SSPE pH7.4PUC19 DNA
9.375pg/ml20×SSPE pH7.4PTZ19R DNA
大鼠腎小管平滑肌細(xì)胞提取物干擾素調(diào)節(jié)因子5(IRF5)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法) (R)-(-)-NBD-APy [=(R)-(-)-4-硝基-7-(3-氨基吡咯-1-基)-2,1,3-苯并惡二唑](>98.0%(HPLC))
細(xì)胞附著蛋白相互作用蛋白(CYTIP)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)(S)-(-)-DBD-Pro-COCl [=(S)-(-)-4-(N,N-二氨基磺?;?-7-(2-氯酰四吡咯-1-基)-2,1,3-苯并惡二唑](>90.0%(HPLC))
B-細(xì)胞連接蛋白(BLNK)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)(R)-(+)-DBD-Pro-COCl [=(R)-(+)-4-(N,N-二氨基磺酰基)-7-(2-氯酰四吡咯-1-基)-2,1,3-苯并惡二唑](>95.0%(HPLC))
B-淋巴細(xì)胞趨化因子1(BLC1)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)(S)-(-)-NBD-Pro-COCl [=(S)-(-)-4-硝基-7-(2-氯酰四吡咯-1-基)-2,1,3-苯并惡二唑]
生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因β(GROβ)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)(R)-(-)-DBD-Py-NCS [=(R)-(-)-4-(N,N-二氨基磺酰基)-7-(3-基四吡咯-1-基)-2,1,3-苯并惡二唑](>98.0%(HPLC))
生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因γ(GROγ)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)(S)-(+)-DBD-Py-NCS [=(S)-(+)-4-(N,N-二氨基磺酰基)-7-(3-基四吡咯-1-基)-2,1,3-苯并惡二唑](>98.0%(HPLC))
脂酰肌醇特性酯酶Cβ3(PLCβ3)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)(R)-(-)-NBD-Py-NCS [=(R)-(-)-4-(3-基吡咯-1-基)-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑](>98.0%(HPLC))
糖脂酰肌醇(GPI)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)(S)-(+)-NBD-Py-NCS [=(S)-(+)-4-(3-基吡咯-1-基)-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑](>98.0%(HPLC))
胸腎表達(dá)趨化因子(BRAK)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-氨酰胺(>95.0%(HPLC))
皮膚T-細(xì)胞虜獲趨化因子(CTACK)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)苯酰氯(>98.0%(GC)(T))
D-二聚體(D2D)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)4-氧基苯酰氯(>98.0%(GC)(T))
抑制素βC(INHβC)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)4-硝基苯酰氯(>98.0%(GC)(T))
Endoglin蛋白(ENG)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)DAABD-Cl [=4-[2-(二氨基)氨基磺酰]-7-氯-2,1,3-苯并惡二唑
肝脂酶(LIPC)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)2,4-二硝基苯肼(加約50%水濕潤(rùn),本品干重分別為約25g和500g)(>98.0%(HPLC))
肝脂酶(LIPC)檢測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)2,3-二-6-基-1,4-酞嗪二(>96.0%(HPLC))
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