培養(yǎng)步驟:
一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備:
1)準(zhǔn)備MEM培養(yǎng)基(MEM:GIBCO,貨號11095-080),85%;北美胎牛血清(United States,GIBCO,貨號16000-044),15%。
2)培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37攝氏度,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3)凍存液:90%*培養(yǎng)基,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。
二.細(xì)胞處理:
1)復(fù)蘇細(xì)胞:將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中,加入約8ml培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜)。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細(xì)胞,傳代可參考以下方法:
1.棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí),可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí),棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶,細(xì)胞變圓脫落后,加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中,再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。
大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞提取物是從大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞提取的,大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞從正常大鼠主動(dòng)脈組織制備。所有的產(chǎn)品在發(fā)貨之前均經(jīng)過嚴(yán)格的QA/QC流程以確保其質(zhì)量。這些產(chǎn)品可以直接用于基因克隆,表達(dá)圖譜分析以及各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究。
總RNA制備:利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA,然后用Qiagen RNA Clean Kit進(jìn)行純化。公司提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度、總含量、電泳照片、OD值測定結(jié)果等。
cDNA制備:純化后的總RNA來合成cDNA鏈,以50ul總反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,體系中包括MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物以及10mg總RNA。68℃反應(yīng)10min 后終止RT反應(yīng)。利用1x RT Buffer 運(yùn)輸cDNA,1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應(yīng)。所有cDNA產(chǎn)品在訂單發(fā)貨之前都經(jīng)過了嚴(yán)格的QA/QC分析,保證了產(chǎn)品的質(zhì)量。
蛋白制備:利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮組織裂解液,離心去除組織碎片,通過Bio-Rad蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度,組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF,-80度保存。
潛在的應(yīng)用: <1>已知基因的PCR克隆;<2>mRNA選擇性剪接;<3>基因克隆與目標(biāo)測序;<4> Western and Northern Blot;<5>蛋白檢測與蛋白質(zhì)組學(xué);<6>芯片研究與表達(dá)圖譜。
產(chǎn)品名稱 | 大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞提取物 |
英文名稱 | Rat Aorta:Normal Aortic Endothelial Cell Derivatives |
貨號 | CS-X3750 |
細(xì)胞分類:
一種:
是凍存產(chǎn)品,由氮直液接拿出,干冰運(yùn)輸給客戶。一般不推薦這種,也較少使用這種方式,因?yàn)閺?fù)蘇手法對于細(xì)胞狀態(tài)影響較大,一旦細(xì)胞狀態(tài)不好,很難說是細(xì)胞自身不行,還是復(fù)蘇沒操作好;另外溫度對細(xì)胞、基因功能狀態(tài)影響很大,也不是細(xì)胞儲(chǔ)存的方式,快遞時(shí)間也很難控制,多種因素影響產(chǎn)品的質(zhì)量;干冰運(yùn)輸需要額外添加400元的運(yùn)費(fèi)(順豐)。
第二種:
是我們復(fù)蘇好細(xì)胞,QC通過后,T-25灌滿培養(yǎng)基常溫運(yùn)輸給客戶,排除復(fù)蘇造成影響,常溫運(yùn)輸也對細(xì)胞影響也不大,只需加25元運(yùn)費(fèi)(順豐)。
質(zhì)量保證:我們的細(xì)胞株來源于ATCC、ECACC、DSMZ、JCRB等,購買到貨后,由我們實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增、凍存,凍存的產(chǎn)品全部經(jīng)過QC檢測,進(jìn)口來源,保證5代以內(nèi),活力>95%,無細(xì)菌、真菌、支原體污染。
細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn):
1.研究的對象是活細(xì)胞
在實(shí)驗(yàn)過程中,根據(jù)要求可始終保持細(xì)胞活力,并可長時(shí)間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一部分活細(xì)胞的情況,包括活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)等。
2.研究條件可以人為控制
pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學(xué)的條件,可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行人為的控制,同時(shí),可以施加化學(xué)、物理、生物等因素作為條件而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察,這些因素同樣可以處于嚴(yán)格控制之下。
3.研究的樣本可以達(dá)到比較均一性
通過細(xì)胞培養(yǎng)一定代數(shù)后,所得到的細(xì)胞系則可以達(dá)到均一性而屬于同一類型的細(xì)胞,需要時(shí),可采用克隆化等方法使細(xì)胞達(dá)到純化。
4.研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄
采用各種研究技術(shù):如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記等各種儀器設(shè)備。
以下是公司正在銷售的相關(guān)產(chǎn)品:
46.875pg/mlCephalothin Sodium Salt 先鋒/頭孢噻吩鈉 sigmaNOLIMITS 35BP DNA FRAGMENT
46.875pg/mlChloramphenicol 氯NOLIMITS 50BP DNA FRAGMENT
7.5ng/mlChloramphenicol 氯NOLIMITS 75BP DNA FRAGMENT
0.375ng/mlchloramphenicol 氯NOLIMITS 100BP DNA FRAGMENT
0.188ng/mlChlortetracycline, hydrochloride 鹽金NOLIMITS 250BP DNA FRAGMENT
0.469ng/mlClarithromycin 克拉NOLIMITS 600BP DNA FRAGMENT
0.469ng/mlClindamycin HCl 鹽克林NOLIMITS 750BP DNA FRAGMENT
0.234ng/mlColistin Sulphate 多粘菌素E鹽NOLIMITS 800BP DNA FRAGMENT
0.938ng/mlColistin Sulphate 多粘菌素E鹽NOLIMITS 900BP DNA FRAGMENT
0.094ng/mlCYCLOSPORIN A 環(huán)孢A NOLIMITS 3500BP DNA FRAGMENT
大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞提取物蛋白酪氨酶受體N(PTPRN)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)核糖核酶A(美侖);RNase A;核糖核酶I
親環(huán)素B(CYPB)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)5‘-吡哆醛,一水
抑制素結(jié)合蛋白(INHBP)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)NADPH;還原輔酶Ⅱ四鈉鹽;(羅氏)
溶菌酶(LZM)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)NADPH;還原輔酶Ⅱ四鈉鹽;(美侖)
干擾素β(IFNβ)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)帕米膦
核糖核酶A3(RNASE3)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)α,α-二苯基-4-哌啶醇
管緊張素Ⅱ受體1(AGTR1)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)葡萄糖氧化酶
主要性蛋白(MBP)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)溶菌酶(蛋清)
管性友病因子裂解蛋白酶(vWFcp)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)HRP;辣根過氧化物酶
激活素A受體Ⅰ(ACVR1)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)透質(zhì)酶
白介素6(IL6)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)抑肽酶(來源于牛肺,胰蛋白酶抑制)
白介素10(IL10)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)E-64,蛋白酶抑制
干擾素γ(IFNγ)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)阿齊沙坦酯
顆粒酶K(GZMK)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)α-淀粉酶
Ⅲ型前膠原羧基端原肽(PⅢCP)檢測試盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)α-糜蛋白酶
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